北京大学生命科学学院 林忠平教授领导下的实验室（AgMoBiol）
主要在以下领域进行工作

（1）         植物对逆境胁迫的抗性基因工程Genetic engineering for plant resistance to environmental stress

（2）         植物生物反应器生产药用蛋白Plant bioreactor for production of pharmaceutical protein

（3）         植物次生代谢的基因调控Genetical control of secondary metabolite in plants

（4）  转基因食品的致敏性评估Assessment of GMO allergenicity

一、提高植物对逆境胁迫的抗性

培育抗旱、抗寒的草坪草（Improvement of turfgrass resistance to drought and cold）

从厚叶旋蒴苣苔、沙蒿等几种极端环境下生长的植物中分离耐旱、耐寒相关的基因。包括上游的转录因子和下游的对细胞起保护作用的基因，以及参与逆境胁迫下信号传递的某些基因。其中包括来自厚叶旋蒴苣苔的两种类型脱水素基因，两种WRKY家族的基因，属于R2R3型的一种Myb基因，一种对缺水和髙渗起反应的蓝铜蛋白基因。来自沙蒿的两种锌指蛋白基因。来自二月兰的一种DREB2B家族的基因。各在研究其功能的基础上，构建了适于在单子叶中表达的载体。通过农杆菌的介导或以基因枪法将其导入草坪草（主要是高羊茅、黑麦草、剪股颖、紫羊茅等）这些草类表现良好的抗旱性，延长绿期等。其中有的也适宜做牧草的。有的基因是依据文献资料克隆的（专利即将过期），如海藻糖合酶基因（tps）和异戊烯基转移酶基因（ipt）效果也很好。大量的田间试验在进行中。有的转基因草类已进入生产性试验阶段。我们同中国农业大学合作进行的草坪草中脱落酸代谢途径的调控以及同中国农科院合作利用Cry8C基因做抗地下害虫（蛴螬）的草坪草均已取得良好进展。此外，也做非转基因的草坪草改良，包括辐射诱变技术的应用。利用这一技术培育的一种细叶髙羊毛已通过国家牧草品种的审定。

我们将上述基因用于棉花的遗传转化（合作单位新疆石河子大学），已取得显著进展。主要采用适于新疆栽培的品种为受体材料，大量的转基因的后代品系在海南扩繁，工作重点即将进入抗逆性和综合性状的优选。

通过遗传修饰提高植物基某些微生物对环境的修复能力（bioremediation）亦已取得成绩。例如它们更能适应污泥的环境，以及在低温下保持较高的代谢强度。

本项目已申请相关专利 8 项（其中2项已受权）。

二、利用转基因植物做为生物反应器产生药用蛋白

（1）         将一种设计的人胰岛素导入植物及高等真菌中表达。目标是做口服型的胰岛

（2）         人表皮修复因子在植物中的表达及应用研究。

（3）  灵芝（紫芝）免疫调节蛋白基因的克隆应用研究。

以灵芝中表达胰岛素为例说明如下：全球糖尿病人已经接近1.5亿，其中仅我国就有近4000万患者，且其发病率还在持续上升。世界口服胰岛素市场潜力大。全球的胰岛素治疗剂的销售可达30亿美元。伴随着相当大的患者人群，不能满足患者的需要已促使一些公司开发用于胰岛素释放的供选择的方法。灵芝具有良好的免疫调节功能，我们将重新设计的新型的人胰岛素基因导入灵芝细胞，使其高效表达人胰岛素。试验证明具有良好的降血糖的功能。其技术要领如下：将人胰岛素的B链和A链通过6个氨基酸的柔性连接短肽连接成一个完整的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF），并在人胰岛素原类似物基因的C端添加了内质网滞留信号（Endoplasmic Reticulum retention signal）编码序列KDEL（Lys-Asp-Glu-Leu-COO-，即KDEL），并命名为人胰岛素原类似物基因InsK。为了有利于合成的人胰岛素可以正确折叠成天然的构象，在人胰岛素的B链与A链之间设计了一个6个氨基酸的柔性连接短肽以代替胰岛素原的C肽。因为对天然人胰岛素的三维结构进行分析发现，B链C端和A链N端的空间线性距离为16.12埃，而线性排列的五肽的最小空间距离为16.0埃，为了不改变融合的多肽链中A链和B链的构象，推测它们之间的连接肽的最小残基数应不少于5个残基。考虑到B链C端和A链N端在空间上的取向相反，连接肽最好能形成β-转角结构。不同氨基酸在形成二级结构时具有不同的倾向和能力，其中Pro和Gly很少形成α-螺旋和β-折叠，而Pro，Gly，Asn，Ser在β-转角的构象中最常见，推测Gly-Pro-Ser的结构最有可能形成β-转角。基于以上考虑，本实验选用的连接肽序列为Gly-Gly-Pro-Ser-Gly-Gly Gly。在转基因灵芝中采用了香菇三磷酸甘油醛脱氢酶（GPD）启动子驱动人胰岛素原类似物基因InsK，并构建了电击法及PEG介导法的表达载体pbinsK和农杆菌介导的表达载体p1300-GinsK。利用这种载体将人胰岛素基因送入灵芝原生质体。经过筛选获得高效表达人胰岛素的菌株。采用ELISA方法检测，以人胰岛素标准品为参照作标准曲线。实验结果表明：人胰岛素原类似物在转基因灵芝中表达量能达到抽提总蛋白的4.40％～10.40％，每克灵芝菌丝鲜重中含有的人胰岛素原类似物质量为105.0µg～174.8µg。灌喂转基因灵芝的大鼠组血糖水平与灌喂未转基因灵芝的对照组相比有极显著性降低P<0.0002），除了2只血糖值下降在误差范围内，余下的80％大鼠血糖值均有大幅度下降，下降的最高幅度可达64％。灵芝作为生物反应器高效表达了人胰岛素原类似物，每克灵芝菌丝鲜重中人胰岛素原类似物的含量可以达到105.0µg～174.8µg的水平。高血糖大鼠灌喂实验表明口服这种转基因灵芝在4小时后可以大幅度降低大鼠的血糖水平，与对照组相比具有显著性差异（P<0.0002）。说明此转基因灵芝可能以口服剂型用于治疗糖尿病的。（专利申请号:200610078845.8）

三、植物次生代谢的基因调控

（1）         精油代谢途径的基因调控――从薄荷、迷迭香、熏衣草等植物中克隆了柠檬烯合酶、芳樟醇合酶基因等，并利用转基因植物的实验系统研究其在精油生物合成中的分子调控。

（2）  大豆异黄酮生物合成途径的分子调控――来源于植物的、与雌激素具有相似结构，并且能够与雌激素竞争性的结合受体，从而对人体激素的代谢和功能产生影响已成为重要的医疗保健用品。它在自然界分布狭窄，主要产生于豆科植物，在植物中对于根瘤菌与植物的共生关系的建立十分重要。通过引入大豆异黄酮合酶基因及其它一些基因的调控可以使非豆科植物某些器官产生大豆异黄酮genistein。但其产量依然较低。

（3）  白藜芦醇生物合成途径的分子调控――白藜芦醇化学名为：3,5,4’-三羟基二苯乙烯，是一种重要的植物抗毒素，具有多种医疗保健作用，如具有预防心脑血管疾病、抗炎、抗癌等作用。人们在对多种植物不同部位中白藜芦醇的含量分析后发现，葡萄皮中白藜芦醇的含量最高，为10-100μg/g FW。可见，白藜芦醇在自然界的含量不是很丰富，但它在制药业、 生物制品和保健功能食品业有着巨大的市场需求。所以提高该化合物在植物中的含量或者使用基因工程手段在异源植物中大量合成白藜芦醇引起广泛的关注。我们从葡萄科植物川鄂爬山虎中克隆了产生白藜芦醇的关键基因，芪合酶基因。将这一基因置于强启动子的调控之下，并在阅读框架的两端加上MARs序列。导入烟草、生菜等植物，使这些本不产生白藜芦醇的植物能够产生白藜芦醇而且产率接近葡萄皮的水平。此种生菜可以照常食用，而更富保健功能。此后我们又从爬山虎中克隆了一种称之为C4H的基因将其导入已有外源芪合酶基因的生菜、烟草等，使其中的白藜芦醇含量提高了数倍以上。转基因烟草叶片中的含量可达239μg/g叶片鲜重。同时可用于提取白藜芦醇。专利名称：利用川鄂爬山虎STS基因培育含白藜芦醇生菜的方法    申请号200510114。

四、转基因食品的致敏性评估

在广泛收集、整理过敏原基因序列和有关过敏原决定簇资料的基础上建立了用于GMO致敏性评估的数据库。同时在研究坚果（胡桃）、螨、草类花粉某些过敏原的基础上建立了检测GMO致敏性的血清学方法。此外，由于食物致敏性可能与某种蛋白质的可消化性有关。因而利用模拟的肠胃消化液进行了某些蛋白的可消化性的检测，判定消化的时间进程和消化后的残余片段的大小。在此基础上建立了电脑模拟的蛋白质可消化预测的方法。

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