项目名称： 生物大分子光散射分析的方法与理论研究

推荐单位： 教育部

项目简介： 在分子光谱分析法中，散射光始终是一个干扰信号。本研究利用这种干扰信号建立了光散射光谱分析方法，形成分子光谱分析的一个新分支。生物大分子（核酸、蛋白质、糖类等）的分析测定是生命科学领域的重要研究课题，光散射光谱分析法大大提高了检测的灵敏度和选择性。

本研究(1)发现某些有机小分子与生物大分子反应使生物大分子的光散射大大增强，并且光散射的增强程度与生物大分子的量成正比，据此建立了生物活性物质的共振光散射光谱分析法；(2)发现了用普通荧光光度计即可测定这种光散射增强信号，并建立了一系列操作简便、灵敏度高的核酸、蛋白质等生物大分子定量分析新方法, 进一步推广到糖类和其他生物活性物质的分析测试；(3)确定了光散射分析的定量基础，提出了光散射强度与物质的量成线性关系的表达函数；(4)建立了界面全内反射光散射分析法、后向光散射分析法和光散射成像等系列光散射分析法, 实现了复杂样品（如血液）的直接分析；(5)发现了发光强度与有机小分子(染料、药物等)和生物大分子的荷电性质、静电结合程度、所形成复合物的大小、形状和数量等信息有关，为设计新型分子探针并研究其与生物大分子的作用机理提供理论指导。

在Anal Chem等SCI收录刊物上发表论文112篇, 被SCI收录的刊物上他引1821次。10篇代表性论文他引597次。其中1996和1997年发表在Anal Chem上的2篇论文的他引次数分别为201和136，在《1994-2004年十年中国的化学高引用论文》中排名第5和第14位（附件4-5-01）。日本分析化学家藤田芳一把该项工作作为研究热点介绍给日本同行（ぶんせき<, 1999, (1) 79<）（附件4-5-02）。分析化学<家胡之德<教授等称"黄等人首先应用光散射技术进行分析测定, 光散射光谱已逐渐成为分析化学中进行核酸和蛋白质测定的有用技术(Anal. Chim. Acta, 2001, 442, 249)"。美国著名分析化学家Marcus教授指出：方法快速、一步的简单操作和允许大部分常见干扰如缓冲液成分存在（Anal Chem, 2003, 75, 4801）。<<

主要发现点： 1、核心发现点：

发现某些有机小分子与生物大分子反应使得生物大分子的光散射大大增强，并且光散射的增强程度与生物大分子的量成正比。为此，将分子光谱法中起干扰作用的散射光信号利用起来，建立了生物活性物质的共振光散射光谱分析法--分子光谱分析学科(代码: 1502515)

发现了用普通荧光光度计即可测定有机小分子与生物大分子作用产生的光散射增强信号，建立了操作简单、灵敏度高的核酸、蛋白质等生物大分子的定量分析新方法（代表论文1－5, 8）, 并进一步推广到糖类和其他生物活性物质（如药物）的分析测试（代表论文10）。

2、其他重要发现点

（1） 通过建立新的光路系统，改进测量方法，建立了系列光散射新分析方法--分子光谱分析学科(代码: 1502515)

全内反射光散射分析法：引进自我设计的液-液界面全内反射系统(专利1), 将分析物萃取到液-液界面上, 提高了方法的选择性。灵敏度比直接光散射分析方法提高1000倍(代表论文6，Anal Chem，2001)，应用于实际血清样品中的白蛋白分析, 不需预分离。

后向光散射光谱分析法：引进角度调节装置和镜面反射系统(专利2), 检测不同角度的散射光, 结合液-液界面光反射建立了后向光散射光谱分析法，灵敏度可达到pg/mL级（代表论文9，Analyst，2005）。

光散射成像分析方法：使用激光激发, 利用CCD收集单个散射粒子的发光信号, 实现了单个粒子的散射表征, 建立了基于单个散射粒子的光散射成像分析方法。检测限达到pg/mL级, 灵敏度比普通的共振光散射分析法和荧光分析法提高1000倍（代表论文7, Anal Biochem，2003）。

（2） 确定了光散射强度与物质的量成线性关系的表达函数--分子光谱分析学科(代码: 1502515)

确定使用荧光光度计测定的光散射信号强度可用函数I＝kcdE2( )表示,。这是光散射分析的定量基础（代表论文2, Anal Chem，1997）。

发光强度强烈地依赖于有机小分子和生物大分子的荷电性质、静电结合强度、所形成复合物的大小和数量。如有机小分子与蛋白质作用，信号增强可用 I = P + ( 113.9 + 1.78 × 10?3MW) c表示。式中 P包含了蛋白质的荷电性质及其与有机小分子静电作用的强度; MW体现蛋白质分子的大小; c为浓度。

主要完成人： 李克安

共同策划了光散射方法的实验设计及测定方法的研究课题；进行了光散射法对染料、药物等小分子物质与蛋白质、核酸以及糖类物质等生物大分子反应的研究，论证了这些反应使得生物大分子的光散射增强程度与生物大分子的量均服从线性关系，建立了一系列光散射测定方法（核心发现点1）。其中糖的测定对食管癌的诊断有实际意义，2005年获河北省科技进步二等奖。

本人主持的 "生物大分子的散射光谱分析的基础与应用研究"被国家自然科学基金委立项支持; 本人负责的"光散射技术用于生物大分子反应的基础与分析应用的研究"获教育部提名国家科学技术奖的自然科学一等奖（2003年）。

本人在该项研究中的工作量占本人工作量的50％。

黄承志

在北京大学攻读博士学位期间在导师童沈阳教授和李克安教授的指导下开始光散射分析研究, 发现小分子在生物大分子表面组装使产生光散射增强现象, 建立了光散射增强与生物活性物质的量成正比的定量模型（核心发现点1）；建立了液-液界面全内反射光散射分析法、后向光散射分析法和光散射成像分析法等系列光散射分析法（发现点2（1））。

对小分子与生物大分子反应产生光散射增强的原理以及光散射法提供散射粒子的形状，大小和状态等信息进行了研究，建立了理论模型（发现点2（2））。对研究生物大分子的行为提供了一种手段。

本人在该项研究中的工作量占本人工作量的80％。

赵凤林

研究了光散射信号增强的必要条件。只有那些可以生成聚集状态、聚合粒子非常大且具有较大的摩尔吸光系数的体系才能导致光散射信号增强；光散射强度与单个生色团的电性质、生色团间的电耦合程度以及由此形成的聚集体的大小密切相关。对于以静电作用为主的分子识别，通常是正电荷试剂与核酸作用，这源于核酸的磷酸根带负电荷；而负电荷试剂通常与蛋白质作用，主要是在低于蛋白质等电点的酸度下蛋白质带正电荷。环境条件如温度、酸度和离子强度影响它们的静电结合能力（发现点2（2）。建立糖类物质的光散射分析法（核心发现点1）。

本人在该项研究中的工作量占本人工作量的50％。

李原芳

用光散射技术研究了蛋白质、核酸等生物大分子与具有抗菌活性的生物染料在体外的相互作用机理，指出有机小分子与生物大分子作用产生的光散射增强与生物大分子的分子量有关，并从分子构效的角度探讨了有机药物分子与蛋白质和核酸分子识别的专一性特征，对新药的体外筛选具有指导作用（发现点2（2））。通过建立新的光路系统,改进测量方法，建立了系列光散射新分析方法（发现点2（1））。

本人在该项研究中的工作量占本人工作量的60％。

童沈阳

作为课题组负责人和研究生导师，带领本课题组于1995年发现，当具有抗菌特性的阳离子卟啉在核酸上聚合组装时，通过荧光分光光度计测定到卟啉共振光散射信号被微量核酸大分子大大增强，且增强的光散射信号与核酸的浓度之间存在线性关系（核心发现点1）。在本课题的思路和实验设计上提出了指导性意见，并积极推进光散射技术的应用研究。与本课题组同志一起，为探讨蛋白质、核酸等生物大分子与小分子探针的作用机理提供了一个检测和表征的重要手段。

本人在该项研究中的工作量占本人工作量的50％。